Biologia Celular - Aula Teórica 15 - Transporte em quantidade

O transporte em quantidade pode também ser chamado de transporte de massa ou em bloco. Pode ser de fora para fora para dentro (endocitose) ou de dentro para fora (exocitose):

- Endocitose
> Fagocitose
> Macropinocitose
> Micropinocitose (ou endocitose mediada por receptores

- Exocitose

Endocitose

Fagocitose

É um processo de macrotransporte, que envolve emissão de pseudópodes.

As principais células que realizam a fagocitose no organismo humano são os macrófagos e os eosinófilos. São chamadas de "células fagocitárias profissionais".

Acontece assim: os antígenos são reconhecidos pelo corpo devido aos anticorpos que a ele estão acoplados. O glicocálice reconhece a porção Fc do anticorpo e envolve o antígeno, formando a vesícula de internalização.



A fagocitose também ocorre por estímulos mecânicos.

Fatores de complemento -> são estruturas (proteínas) que auxiliam na defesa, ligando-se ao corpo estranho.

Clasmocitose

- fagossomo + lisossomo -> fagossomo - eliminado da célula

Sistema comum em protozoários, raro em humanos.

Autofagia

Remoção de organelas e estruturas pelos lisossomos.

Há mecanismos de escape da fagocitose, como:

- Bacilo de Tuberculose: impede fusão de lisossomas e fagossomas.
- Tripanosoma da Doença de Chagas: digere a membrana que a envolve.

Macropinocitose

É o englobamento de células próximas a meios líquidos. Exemplo de células que realizam esse tipo de transporte são as células do endotélio dos testículos.

Há o recolhimento de material em solução, sem reconhecimento. Não é específico e ocorre grande entrada de água na célula.

Pode ocorrer de fora para dentro (nutrientes) ou de dentro para fora (excretas).

Micropinocitose

É o englobamento de partículas de pequenas dimensões. Vantajosa para células afastadas do meio aquoso. Pode acontecer de duas maneiras:

- inespecífica: a célula capta pequenas quantidades de material extracelular sem reconhecimento. É como se a célula ficasse constantemente "sugando" o meio. Ocorre na maioria.

- específica: é mediada por receptores, que reconhecem determinados compostos e fazem a endocitose de acordo com as necessidades do tipo celular.

Micropinocitose específica

Acontece segundo os seguintes passos:

1) Contato do composto com os receptores
2) Reconhecimento
3) Invaginação localizada da membrana, auxiliada por clatrinas - proteínas solúveis do citoplasma que se polimerizam em estímulo ao início da macropinocitose e formam redes hexagonais que revestem a vesícula micropinocítica, dando sustentação e facilitando o processo de entrada na célula. Também servem de ancoragem ao citoesqueleto.
4) Fusão das MB. Requer temperatura, Ca++ e proteínas fusiogênicas
5) Cisão da vesícula, com a MB (proteína dinamina)

*Importânca: há captação de compostos específicos sem internalização de grande quantidade de água.

Modelo clássico: endocitose da LDL (low density lipoproteins)

Além do colesterol, captação de muitos outros metabólitos essenciais como ferro e vitamina B12.

Digestão intracelular

Sistema Endossômico-Lisossômico

Endossomo primário - jovem (mais próximo da membrana)
Endossomo secundário - madura (perinuclear, afastado da membrana)

Para que ocorra a digestão, o material deve perder as redes de clatrina.

Passos:

O pH do interior do endossomo 1ªrio é reduzido, fazendo com que as ligações proteicas se soltem e o que foi micropinocitado fica solto dentro do endossomo. A vesícula com o material de interesse forma o endossomo secundário e, após modificações, há a fusão com enzimas hidrolíticas vindas do complexo de Golgi. A fusão dessas duas vesículas forma o lisossomo, onde ocorre a degradação do material.

Se não perder as clatrinas, pode ocorrer:

- Armazenamento -> uso posterior.

- Transcitose -> o material é levado de uma célula para outra, com o revestimento de clatrina.

Doenças de armazenamento ou depósito
Doenças de arrebentamento de membranas endossômicas

Problemas motores, de desenvolvimento e mentais.
Problemas respiratórios e funcionais de pulmão.

Biologia Celular - Aula Teórica 14 - Transporte ao nível molecular

Difusão Facilitada

- a favor do gradiente

- impulsionada pelos gradientes

Difusão facilitada mediada por translocadores

É um tipo de difusão mediada por proteínas, chamadas genericamente de tranlocadoras, carreadoras, carreases ou permeases. Essas proteínas são extremamente específicas para seus solutos, como enzima e substrato. A ligação do soluto promove uma transformação de conformação, permitindo a passagem do soluto para o outro lado da membrana.

O transporte pode ocorrer tanto de fora para dentro como de dentro para fora, e tal fênomeno recebe o nome de "pingue-pongue".

Pode ocorrer de duas maneiras:

- uniporte:

Apenas uma molécula por vez é transportada.

- co-transporte:

Mais de uma molécula é transportada de uma vez. Pode ser:

> simporte - mesmo lado no transporte
> antiporte - lados contrários no transporte

Nesse tipo de transporte, o íon transportado junto com a molécula dirige o movimento. Ele sempre vai a favor do seu gradiente de concentração, e co-transporta uma molécula contra o seu gradiente.

Exemplos

- A glicose entra nas células absortivas intestinais por simporte dirigido pelo sódio.

- O HCO3- do sangue entra nas células sanguíneas (para controle do pH) por antiporte dirigido pelo íon cloreto.

Transporte Ativo (primário)

Ocorre contra o gradiente elétron-químico. Necessita de uma quantidade grande de energia, que provém da hidrólise de ATP.

"Bombas de íons"

São os sistemas moleculares de membrana que, com a ajuda de translocadores, transportam íons contra o gradiente de concentração.

Exemplos:

- bomba de Na+/K+ ATPase

K+: principal íon extracelular - entra
Na+: principal íont intracelular - sai

Antiporte assimétrico, pois ocorre com 3Na+ para dentro e 2 K+ para dentro.

Serve para auxiliar a passagem dos impulsos nervosos e a contração muscular.

- bomba de H+ / ATPase

Ajusta o pH do sangue.

- bomba de K+/H+ ATPase

- bomba de Ca++/ ATPase

Canais vazantes (Leak channels)

São os canais iônicos pelos quais íons em excesso "extravasam pela membrana". Ocorre a favor do gradiente de concentração (transporte ativo indireto).

Transporte Ativo Primário -> transportadores específicos - ATPases.
Transporte Ativo Secundário -> utiliza energia dos gradientes.

Biologia Celular - Aula Teórica 13 - Transporte em quantidade

O transporte através das membranas pode ser dividido em dois tipos:

- transporte ao nível molecular (íons e pequenas moléculas);

-transporte em quantidade (grandes quantidades de material);

Transporte ao nível molecular

As membranas possuem permeabilidade seletiva, importante para manter as condições intracelulares satisfatórias, uma vez que a diferença entre o MEC e o MIC é grande.

Pequenas moléculas não carregadas difundem-se através da membrana, enquanto moléculas grandes e partículas carregadas (como íons) não conseguem fazer o mesmo.

Esse tipo de transporte pode ser do solvente ou do soluto.

Transporte de Solvente (Água) - Difusão Osmótica

Se dá do meio menos concentrado (mais diluído) para o mais concentrado (menos diluído). Esquematicamente:


O transporte de solvente também pode acontecer por aquaporinas, que são proteínas transmembrana que atuam como poros. Esse tipo de transporte é mais rápido que a osmose.

Transporte de Soluto

As várias moléculas apresentam diferentes coeficientes de permeabilidade através da membrana.

A velocidade do transporte é diretamente proporcional à concentração de soluto na solução.

O que atravessa e o que não atravessa a membrana?

- Atravessam:
> moléculas hidrofóbicas
> moléculas pequenas não carregadas polares

- Não atravessam:
> Íons
> Moléculas grandes e não carregadas polares

O transporte pode ocorrer a favor do gradiente de concentração, com baixo gasto energético, ou contra o gradiente de concentração, com alto gasto energético..

O transporte de soluto pode ser por:

1. Difusão simples:

É o transporte a favor do gradiente de concentração. As moléculas passam através da bicamada. Ocorre com gases, moléculas hidrofóbicas ou moléculas polares pequenas.

Obedece a Lei de Fick: a velocidade da difusão simples é diretamente proporcional à concentração de soluto.

O que impulsiona o transporte é o próprio gradiente químico.

2. Difusão facilitada:

Ocorre com moléculas polares grandes ou moléculas carregadas e íons.

É mediada por canais iônicos (canais protéicos aquosos): são proteínas canais, abundantes em tecidos excitáveis. O canal é específico do íon (Na+, K+, Cl-, etc), determinado geneticamente.

Esses canais não ficam permanentemente abertos. Abrem-se apenas transitoriamente, para manter a concentração celular estável. Para abrir, recebem certos tipos de estímulos, que podem ser:

- moléculas químicas: mediadores químicos , hormônios, etc. Os canais são chamados porta-ligando.

- sinais elétricos: cargas elétricas, diferença de voltagem. Os canais são chamados porta-voltagem.

- estímulos mecânicos: com o toque de algo.

A energia para esse transporte pode ser obtida pelo gradiente químico (agitação dos íons), segundo a Lei de Fick, ou pelo gradiente elétrico (repulsão dos íons), segundo a Lei de Du Fay.

Biologia Celular - Aula Teórica 12 - Citoesqueleto

Microtúbulos

Cinesinas

O movimento celular depende de cinesinas, que são proteínas motoras com dois sítios de ligação a microtúbulos, sendo que apenas um se liga de cada vez e há revezamento. Há gasto de ATP. Move-se na direção + dos microtúbulos. É lenta e descontínua, atuando de maneira centrífuga.

Dineínas

Outras proteínas que realizam movimento celular são as dineínas, na direção -. É rápida e contínua, atuando de maneira centrípeta.


Cílios

São apêndices finos para movimentação de fluidos e deslocamentos celulares.

O movimento ciliar se dá pela curvatura de um axonema (microtúbulos e proteínas associadas = 9 pares de microtúbulos + um par central). Esse movimento pode ocorrer devido ao:

- movimento de chicote
- movimento sincrônico (ondulatório)

Flagelos

Semelhantes aos cílios, mas mais longos e em menor número.

O movimento flagelar se dá pela curvatura de um axonema, na forma de movimento quase-sinusoidal.

Os axonemas são microtúbulos associados a proteínas e envoltos por uma MB. Em cílios e flagelos, são compostos por 9 pares de microtúbulos periféricos e um par central. Os pares periféricos estão unidos por nexina, enquanto o par central não possui compartilhamento de microtúbulos.

Corpúsculos Basais

São estruturas análogas a centríolos, formadas por nove trincas de microtúbulos periféricos. Dão origem a cílios e flagelos. Não se conhece a formação do par central. A estrutura é a mesma dos centríolos.

Faz movimento ciliar e flagelar.

- Dineínas + MAPs estruturais: curvatura do axonema.
- Dineína ciliar: domínio motor (move-se em direção à extremidade do microtúbulo).

Fuso mitótico

É uma estrutura formada pelo microtúbulo mais simples.

Durante intérfase há 1 centrossomo, enquanto durante a divisão celular há 2 centrossomos.

Os microtúbulos do fuso mitótico podem ser dos tipos:

- áster: são menores e têm a função de estabilizar o fuso;
- polares: saem do centrossomo e vão até a placa equatorial, mas não se ligam a nada;
- de cinetócoros: ligam-se aos cromossomos.

Microfilamentos de actina

São as proteínas mais abundantes do citoesqueleto, sendo formadas por polipetídeos de 375 aa contendo 1 ATP. Podem formar estruturas estáveis ou lábeis. São polarizadas (regiões + e -). Podem ser do tipo alfa-actina (células musculares) ou beta e gama-actina (células não musculares).

Actinas são monômeros de forma globular, e seus polímeros formam os microfilamentos.

Polimerização

A polimerização dos filamentos de actina ocorrem de maneira semlhante às tubulinas. Há gasto de ATP e necessita-se de íons monovalentes (K+ e Mg+). Também passa pelas três fases (latência, crescimento e platô).

O alongamento ocorre nas duas extremidades, sendo que a velocidade do alongamento é proporcional à concentração de subunidades livres e é diferente para as duas extremidades. A hidrólise do ATP enfraquece as ligações.

Nucleação e complexo ARP

Complexo ARP é um complexo protéico que se liga à extremidade - dos microfilamentos de actina para estabilizá-los. Quando desligam-se da extremidade, ocorre despolimerização. Os ARP permitem a ligação entre os filamentos de actina.

Organização do citoesqueleto de actina

O citoesqueleto de actina organiza-se em:

- feixes: actina em feixes paralelos;

- redes: actina em ângulos retos.
> rede associada à MB: rede cortical (forma e movimentação celular)
> rede interior da célula

Proteínas associadas aos filamentos de actina ligam a actina às proteínas transmembrânicas ou interligam a actina. São específicas à célula ou à estrutura.

Filamentos Intermediários

Não são dinâmicos quanto actina e microtúbulos. Logo, sua função é mais estrutural. São fibras duras e resistentes, formados por polímeros de proteínas fibrosas. Encontram-se na lâmina nuclear, no núcleo, em desmossomos, etc.

Sua estrutura é composta de uma cauda carbóxi-terminal, uma cabeça amino-terminal e um domínio bastão (repetições hepta, de 7 aa, que se repetem).

Sua formação ocorre da seguinte maneira:

Lâmina Nuclear

É uma malha de filamentos intermediários associados à membrana nuclear. Sua função é auxiliar na forma do núcleo e no ancoramento dos cromossomos. Nos poros nucleares, não encontramos a lâmina.

A lâmina nuclear é formada por lamininas com dinamismo (capacidade de fosforilação e desfosforilação).

Características lâmina:

- domínio bastão-central é menor
- sinal nuclear de transporte
- padrão entrelaçado bidimensional

É encontrada em animais multicelulares.

Biologia Celular - Aula Teórica 11 - Citoesqueleto

O citoesqueleto é uma estrutura de natureza protéica, característica de células eucarióticas, formada por filamentos de actina, microvilosidades e filamentos intermediários. O citoesqueleto consome muita energia, tendo em vista o fato de estar em constante polimerização e despolimerização.

Funções do citoesqueleto:

- movimentos celulares;
- movimentos intracelulares;
- comunicação celular;
- localização intracelular de organelas;
- suporte mecânico;
- origem de estruturas como cílios, flagelos e centríolos.


Microtúbulos

São tubos protéicos longos, finos e ocos, relativamente rígidos. Realizam a localização intracelular de organelas e componentes celulares.

São estruturas cilíndricas formadas por 13 protofilamentos lineares dispostos de maneira periférica, com 24 nm de diâmetro, com região positiva e região negativa.

Sua constituição é por dímeros de alfa e beta-tubulina. A região mais possui beta-tubulina, enquanto a região menos possui alfa-tubulina. A estrutura seria o seguinte:



Os microtúbulos apresentam sua organização da seguinte forma:

Estão frequentemente presentes no tecido nervoso. Ligações alfa-beta-tubulina são não covalentes fortes, e entre os dímeros são não covalentes mais fracas.

Os microtúbulos são mantidos pelo equilíbrio entre montagem e desmontagem. A instabilidade relativa dos microtúbulos dá a eles a possibilidade de sofrer um remodelamento rápido contínuo, crucial para sua função. Portanto, a polimerização e a despolimerização são processos importantes, estimulados pelo núcleo, pelo citoplasma e por hormônios.

Nucleação: formar um microtúbulo do início.
Alongamento: formar um microtúbulo a partir de uma estrutura já iniciada.

A produção de microtúbulos é composta por três etapas:

1. fase de lactência

2. fase de crescimento

3. platô (equilíbrio)
O fator limitante do crescimento de microtúbulos é a concentração plasmática de alfa e beta tubulina.

Montagem de microtúbulos


A célula esforça-se para manter a concentração crítica (Cc) de alfa e beta tubulina constante, com a mínima quantidade de tubulina necessária para o meio celular.

Os fatores que virão a interferir no processo de montagem são:
1. temperatura

- até 4 ºC, há favorecimento de despolimerização;
- mais de 37 ºC, há favorecimento de polimerização.

2. concentração de alfa e beta tubulina

- acima de Cc: polimerização;
- abaixo de Cc: despolimerização.

A região + tem maior velocidade de adição que a região -. Em células vivas, a região - está estabilizada e não há despolimerização

Desmontagem de microtúbulos

A desmontagem dos microtúbulos é rápida e desordenada, diferente da montagem.

Instabilidade dinâmica

Perídos de oscilação entre polimerização (alongamento) e despolimerização (encurtamento).

Centrossomos - sítios primários de nucleação

São os centros organizadores dos microtúbulos. São compostos de centríolos + material pericentriolar / matriz do centrossomo -> região rica em alfa e beta-tubulina.

A montagem se dá da seguinte maneira:





MAPs

São proteínas ligadas aos microtúbulos com a função de auxiliar na estabilização desses microtúbulos e na interação deles com outros componentes.

Podem estar amplamente distribuídas ou restritas.

São divididas em:

- MAPs estruturais

- MAPs motoras

MAPs estruturais

São responsáveis pela estrutura e pela sustentação dos microtúbulos. Atuam em cílios, flagelos e centríolos.

Podem estar amplamente distribuídas ou restritas.

MAPs motoras

São responsáveis pelo movimento celular. Pertencem a dois grupos: dineínas ou quinesinas (cinesinas).

Estão presentes em axônios, melanóforos e no transporte vesicular.

Biologia Celular - Aula Teórica 10 - MB: Especializações/junções

Junções Comunicantes ou Junções GAP

Esse tipo de junção ocorre na maioria das células dos animais superiores. Não é encontrada em células sanguíneas, musculares e esqueléticas.

Essas junções são compostas por canais hidrofílicos que ligam os citoplasmas de células vizinhas. Esses canais possuem dois conéxons com 6 conexinas cada. Têm a função de transporte de substâncias. Há diversos tipos de conexinas, dependendo da genética.

As junções comunicantes homotípicas são minoria, enquanto as heterotípicas são maioria.

Dependendo do que se quer transportar, há variabilidade nos canais comunicantes.

Transporte célula-célula

- acoplamento metabólico ou cooperação metabólica:



- AMP cíclico

- Ca 2+: contração muscular


Regulação da permeabilidade

As junções gap regulam a permeabilidade através de estruturas dinâmicas:

- estados aberto <-> fechado
> baixo pH / alta [Ca 2+] => fechamento

Importância nas células de embrião:

- vias de sinalização de longo alcance
- criação de gradientes de concentração

Importância fisiopalógica:

- tecidos excitáveis, como o nervoso: rapidez
- células de Schwann: intercâmbio de nutrientes
- células endócrinas e exócrinas: amplificação da resposta secretória

Junções GAP x Doenças:

Doença de Charcot - Marie - Tooth
> Neuropatia = desmielização e degeneração - nervos periféricos -> alteração nas células de Schwann
> Sintomas: fraqueza, atrofia muscular e deformação dos pés


Junções Célula-Matriz

1. Junções de adesão focal

São junções entre célula e matriz extracelular, realizadas por filamentos de actina. A função dessas junções é justamente a adesão da célula na matriz extracelular. Ocorre principalmente em células livres e amorfas que precisam se fixar no meio (com as proteínas do meio).

Proteínas Integrais

- Integrinas

São glicoproteínas heterodímeras (16 tipos de alfa e 8 tipos de beta) ligadas ao citoesqueleto de um lado e a receptores da matriz do outro.

Proteínas de Ligação (Citosólicas)

- Talina
- Vinculina
- Paxilina ou Quinase FAK

A ligação extracelular das integrinas pode contribuir na sinalização de dentro para fora da célula. Isso ocorre quando um sinal elétrico ativa as integrinas para se ligarem a uma substância da matriz extracelular. Exemplo disso: coagulação.

2. Hemidesmossomos

- aderem a célula na lâmina basal
- auxiliam na resistência ao estresse mecânico
- ocorrem na epiderme, no epitélio gastrointestinal, nas glândulas mamárias, no epitélio de transição da bexiga, etc.

Proteínas Integrais

- adesão: células na matriz extracelular/lâmina basal
- integrinas: subtipo alfa6beta4: liga-se à laminina tipo 5

Proteínas de Ligação

- BP230
- BP180: proteína integral que estabiliza a ligação integrina - citoesqueleto

Doenças auto-imunes na pele:

Penfigóide bolhoso

- mesma doença dos desmossomos
- anticorpos: BP180 - lâmina basal

Epidermólise bolhosa

- atresia pilórica (o indivíduo não forma canais - glândulas, pêlos, etc)
- mutações nos genes alfa-6 e beta-4


Microvilosidades

São especializações digitiformes, formando-se a partir de evaginações da membrana plasmática. Formadas por filamentos de actina (citoesqueleto) + proteínas associadas. Possuem uma teia (ou trama) terminal, composta por espectrina.

Estereocílios

São prolongamentos imóveis da membrana plasmática. Não há nenhuma relação com cílios. Ocorrem no epidídimo e em outros ductos do aparelho reprodutor masculino. Sua função é aumentar a área.

Interdigitações

São especializações célula-célula. Consistem de expansões digitiformes que entrelaçam as células. Ocorrem nas células epiteliais e nas células do útero e do ovário. Sua função é de adesão celular.

E assim terminamos a parte de especializações de membrana.

Biologia Celular - Aula Teórica 09 - MB: Especializações/junções

As especializações são elementos altamente dinâmicos da MB, e o mau funcionamento dessas estruturas pode acarretar em patologias.

São elas as seguintes:

- Junções intercelulares
> junção de oclusão \
> junção aderente - complexo unitivo
> desmossomos /
> junção comunicante

- Microvilos - microvilosidades

- Estereocílios

- Interdigitações

- Outros



Junções Intercelulares

Junção de oclusão

É uma faixa contínua formada por ocludinas e claudinas, localizada na parte apical de células epiteliais. Sua função é vedar total ou parcialmente o trânsito de íons e moléculas por entre as células. Assim, realizam o controle celular, fazendo com que as partículas passem por dentro da célula. Outra função da zona oclusiva é permitir que existam diferentes potenciais elétricos nas duas faces da camada epitelial.

Junção aderente

É uma espécie de cinturão que fica logo abaixo da junção de oclusão, atuando na adesão celular, na polaridade celular e no reconhecimento celular.

As responsáveis por essa adesão são as proteínas caderinas, que ligam-se ao citoesqueleto através de filamentos de actina.

As caderinas são CAMs (moléculas de adesão celular) que necessitam de Ca++ para fazer a junção celular.

Outras CAMs são as imonoglobulinas (Ig), que não dependem de Ca++ para atuar, como a N-Cam, que atua na junção aderente das células do tecido nervoso.

No reconhecimento celular, temos interações homotípicas (entre células do mesmo tecido) e heterotípicas (entre células de tecidos diferentes). Nas homotípicas, as caderinas fazem adesão celular, enquanto nas heterotípicas não. Isso facilita a organogênese, pois células do mesmo tecido tendem a se juntar.

Desmossomos

Desmossomos são proteínas lineares e paralelas de ligação entre citoesqueleto e proteínas integrais de membrana, possibilitando conexão entre citoesqueleto de duas células distintas. Os filamentos intermediários do citoesqueleto ligam-se à desmogleína ou à desmocolina (ambas são caderinas desmossômicas) da membrana.

Os desmossomos ocorrem em qualquer região, podendo ser vistos ao ME.

Proteínas de ligação: placoglobina e desmoplaquina.
> Essas proteínas interligam e estabilizam a ligação caderina - citoesqueleto.

Desmossomos x Doenças auto-imunes da pele

> pênfigo: produz anticorpos contra as próprias caderinas desmossomais (desmogleína)
- perda de adesão celular
- dermatose (bolhas na pele)
- morte

Biologia Celular - Aula Teórica 08 - Microscopia Eletrônica

A aula de Microscopia Eletrônica inicia-se com a apresentação de dois tipos de ME:

- Microscopia Eletrônica de Varredura

- Microscopia Eletrônica de Transmissão

Ambas possuem algumas características em comum, como:

- fixação pelo glutaraldeído
- pós-fixação pelo tetróxido de ósmio
- desidratação em série alcoólica ou acetona

Porém, há também diferenças entre elas, como:

M.E.T.

- material deverá ser incluído em resinas especiais

- microtomia - cortes ultrafinos

- contrastação com metais pesados

M.E.V.

- material deverá passar por secagem

- evaporação com ouro na superfície a ser analisada

- não necessita de contrastação

Microscopia Eletrônica de Transmissão

- fixação: estabilização de estruturas
ex.: glutaraldeído, paraformaldeído, ósmio...

- obtenção de cortes semifinos/finos

- pontes cruzadas: fixador - componentes estruturais

- fixação química

Microscopia Eletrônica de Varreduras

- ponto crítico: retirada total de água do sistema
> CO2: remoção total do etanol
> energia cinética = gás

- metalização
> adiciona-se metal na superfície da célula -> aumenta a condutividade da amostra
> utiliza-se ouro e paládio


Esquema Geral

MET

* filamento de tungstênio - cátodo/produção de elétrons

* placa perfurada - ânodo/forma o feixe de elétrons

* bobina 1 ou lente magnética - direciona o feixe

* bobina 2 ou "objetiva" - dá o limite de resolução

* bobina 3 - projeção de elétrons

* vácuo e refrigeração

MEV

* trajeto dos elétrons - igual ao MET

* elétrons secundários - coletor - amplificador - pontos

* imagem - na tela do monitor

Fim da aula sobre microscropia eletrônica.

Biologia Celular - Aula Teórica 07 - Téc. Histológicas: lâminas permanentes

A aula de hoje será voltada ao estudo de técnicas histológicas, mais especificamente no que diz respeito a lâminas permanentes.

O primeiro passo é coletar o material a ser observado. Em seguida, faz-se a segmentação do material, seguida pela fixação.

A fixação é importante para impedir ataques bacterianos, autólise celular, autólise de organelas, transformação de substâncias e perda de substâncias lábeis e solúveis.

Nesse contexto, vale ressaltar que a velocidade da fixação varia em função da seguinte fórmula:



d -> difusão do fixador
v -> velocidade de fixação
t -> tempo de exposição


A velocidade ainda depende de outros fatores, como:

- características químicas do fixador
> reação com proteínas
> penetração de outros fixadores
> velocidade individual

- características célula/tecido
> homogeneidade tecidual
> vias de penetração

- tamanho da peça

No entanto, há um lado negativo na fixação. Ela pode acarretar em certas modificações (artefatos):

- volume tecidual, causando inchaço ou enrugamento; causas:

> permeabilidade da membrana;
> inibição do processo respiratório;
> modificações no transporte de sódio;
> processos não compreendidos.

- osmolaridade

O ideal seria a que a pressão osmótica fosse igual dos tecidos. Porém, os precipitadores de proteínas enrugam as células e os não precipitadores de proteínas incham as células.

Alguns fatores alteram o processo de fixação. São eles:

- tamanho da peça
- agitação
- calor
- viscosidade
- vácuo
- microondas

Categorias de fixadores

Os fixadores podem ser de três tipos:

- microatômicos;

- citoquímicos;

- histoquímicos.

Desidratação (série crescente de álcool)

Substâncias usadas na desidratação

- Álcool
- Álcool isopropílico
- Dioxano

Fatores que interferem na desidratação

- Tamanho da peça
- Agitação
- Calor

Diafanização (retirada de álcool)

Possibilita a impregnação e a inclusão.

Substâncias usadas:

1. Xileno e Tolueno
> vantagens: rápido, transparente
> desvantagens: inflamável, rígido, tóxico

2. Clorofórmio
> vantagens: não produz esfarelamento, não é inflamável, pode ser deixado por bastante tempo descansando
> desvantagens: não muda o índice de refração, é cancerígeno

3. Óleo de Cedro
> vantagens: viscoso, não endurece, bom para tecidos delicados
> desvantagens: lento

A impregnação e a inclusão devem possibilitar:

- cortes finos
- nitidez
- coloração intensa
- evitar a contração do material

Viscosidade do meio de inclusão serve para:

- coesão molecular
- temperatura
- tempo

Substâncias usadas no processo de impregnação:

1. Parafina
2. Parapalast
3. Glicol estereato

O processo que segue é a microtomia, que consiste no próprio corte. A qualidade dos cortes depende do: formato dos cristais, dureza dos cristais, tamanho e grau de adesão.

Os cortes podem ser:

- Finos:
> baixa quantidade de cristais
> baixa força cristalina
> alta força da gravidade sobre o corte

- Espessos:
> alta força cristalina
> alto deslocamento de cristais

A parafina é retirada e o material é hidratado em concentrações decrescentes de álcool. O próximo processo é a coloração.

Os corantes utilizados são compostos aromáticos, derivados do benzeno, com ligações instáveis e variabilidades nas ligações.

Compontes do corante:

Auxocromos - radical saligênico (OH, COOH, NH2, SH...)

Cromogênio - radical cromóforo (não saligênico) + benzeno (hidrocarboneto cíclico/fixo)

A cor resultante é efeito do comprimento de onda eletromagnético que forma imagem e raios luminosos absorvidos e refletidos.

Fim de aula.

Biologia Celular - Aula Teórica 06 - MB: Glicocálix

Nessa aula, discutiremos sobre o glicocálix (ou glicocálice).

O glicocálice é uma camada glicídica de espessura variável constantemente renovada e presente em todas as células animais. É constituído por hidratos de carbono ligados covalentemente a lipídios e proteína (ou seja, são os açúcares de membrana).

Glicoproteínas
+
Proteoglicanas = Glicocálix
+
Glicolipídios

Porção constante do glicocálice: porção glicídica de glicoproteínas e glicolipídeos.

Porção variável do glicocálice: as glicoproteínas e as glicosaminoglicanas, que são primeiramente secretadas pela membrana plasmática e depois aderidas por ela (adsorção).

Para corar o glicocálice, utiliza-se o P.A.S. ou o azul de metileno.
Funções do Glicocálix

- Proteção: agressões químicas e mecânicas;

- Barreira de difusão: opera como filtro, com base no peso molecular;

- Cria um microambiente especial na superfície da célula: varia de célula para célula em carga, força iônica, etc;

- Enzimática: algumas reações são catálisadas por enzimas do glicocálice, entre elas a dipeptidase, a lactase e a dissacaridase;

- Antigênica: reconhece self de non-self. O glicocálice faz parte do MHC (complexo maior de histocompatibilidade), ou seja, reconhece aquilo que é do organismo e aquilo que não é. É a "impressão digital" da célula;

- Reconhecimento celular: pode ser tanto tecido-específico quanto específico-específico;

- Cimento celular flexível: adesão entre células;

- Inibição por contato: o contato físico entre as células de um tecido dispara sinais químicos que inibem a mitose. Isso impede que células cresçam sobre as outras.

Assim termina a aula sobre glicocálix.

Biologia Celular - Aula 05 - MB: Características e funções

A membrana biológica, vista ao M.E., apresenta-se da seguitne maneira:




Chamamos esse modo de visualização de unidade de membrana. Ela apresenta aspecto trilaminar e pode ser corada por metais pesados, como Os e Pb (na forma de tetróxido).

Características das membranas:

- Pequena espessura
> entre 6 e 10 nm
> visível apenas ao ME
- Fluidez
- Assimetria

As células em geral são envolvidas por uma unidade de membrana, enquanto as mitocôndrias são envolvidas por duas unidades de membrana. As bainhas de mielina, por sua vez, possuem várias unidades.

Fusão de célua humana + célula de camundongo

Um experimento foi feito fundindo-se células humanas a células de camundongos. Depois de um tempo, os marcadores antigênicos estavam distribuídos de maneira igual ao longo da célula. A conclusão disso é que há deslocamentos na MB, e a sua fluidez é o que permite essa movimentação.

Os lipídios podem se movimentar de três maneiras nas membranas:

1) difusão lateral
2) difusão rotacional
3) "flip-flop" (este é incômodo, pois gasta energia e requer enzima para catálise)

A fluidez é determinada pela composição dos ác. graxos:

- saturados: rigidez
-insaturados: fluidez

A temperatura também é um fator que interfere na fluidez, além do colesterol (quanto mais colesterol, menos fluidez) e do tamanho da cadeia (quanto maior a cadeia, menor a fluidez).

Quando a fluidez da MB diminui muito, os movimentos das células ficam mais restritos. Assim, a movimentação do citoesqueleto também é reduzida. Isso também interfere nas especializações da membrana. Mas como não as vimos, fica difícil tratar disso agora.

Assimetria

Pode ser química ou funcional.

- química: faces interna e externa diferentes, em aspecto e em composição.

- funcional: há diferentes funções para cada camada, principalmente quando trata-se de funções enzimáticas.

Fim da quinta aula.

Biologia Celular - Aula Teórica 04 - MB: Características e funções

Apesar do nome da aula, restou falar algumas coisas sobre a estrutura da membrana plasmática.

Primeiramente, falou-se em proteínas periféricas. Têm função estrutural, ajudam a manter a forma das células.

Exemplo é a espectrina, que compõe a MB dos eritrócitos, permitindo a passagem de ar.

Açúcares de membrana

Os açúcares de membrana são polares e estão associados aos lipídios e às proteínas da membrana, formando os compostos glicoproteicos e glicolipídicos. Nunca encontrar-se-ão individualizados.

Tipos de membrana:

- membrana rica em proteínas (75 a 80% de proteínas)

- membrana plasmática (50% de proteínas / 50 % de lipídios)

- membrana mielínica (75 a 80% de lipídios)

Estrutura da Membrana

1985 - Modelo de Overton: natureza lipídica; as MBs se sintetizam por automontagem.

1926 - Gortner e Grendel: bicamada lipídica.

1943 - Davson e Daniell: proteínas e poros.

Robertson: proteínas + carboidratos.

1972 - Singer e Nicolson:

Proteínas embebidas na bicamada lipídica.

Modelo do Mosaico Fluido.

Criofratura

A criofratura consiste de um resfriamento seguido pelo corte da membrana plasmática, da seguinte maneira:




A camada superior é chamada de face E, voltada para o meio extracelular, e a camada inferior é chamada de face P, voltada para o meio intracelular (ou protoplasmático). Quando se realiza a técnica da criofratura, há predomínio de proteínas na face P. Isso é justificado pelo fato de a maioria das proteínas de membrana estarem ancoradas no meio intracelular.

Fim de aula.

Bioquímica - Aula Teórica 03 - Proteínas: estrutura e função

Iniciamos apresentando as funções biológicas das proteínas:

- Catálise de reações;
- Transporte;
- Armazenamento;
- Motilidade (capacidade de se mover espontaneamente);
- Estrutural;
- Defesa;
- Regulação;
- Homeostase e coagulação sanguínea;
- Nutrição de tecidos;
- Tamponamento;
- Manutenção da distribuição da água entre os compartimentos intersticiais e o sistema vascular do organismo.

Função estrutural

As principais proteínas com função estrutural são o colágeno, a elastina e a queratina. O colágeno é a proteína mais abundante do corpo humano. Em sua composição, predominam os aminoácidos prolina e glicina. A estrutura consiste em uma tripla hélice voltada para a esquerda. Quando o colágeno ainda tem fibras esfiapadas em suas partes terminais, ele é chamado procolágeno, e quando perde suas partes terminais, passa a se chamar tropocolágeno.

Proteínas Globulares

Exemplos de proteínas globulares são a mioglobina e a hemoglobina.

A mioglobina é uma proteína com função de transporte intracelular e armazenamento. É monomérica e conjugada. Serve principalmente para fornecer oxigênio aos músculos.

A hemoglobina é uma proteína com função de transporte sistêmico. É oligomérica (4 monômeros) e conjugada. Serve principalmente para transportar gases ao longo de todo o corpo humano.

Hemoglobina

As hemoglobinas podem ser dos seguintes tipos:

HbA1 - 95 % do total
HbA2 - 2% do total
HbF - menos de 5 % do total (porém, no perído de gestação, chega a 60%)

As proteínas possuem o grupo heme, que é a ferroprotoporfina IX. Esse grupo heme ocupa uma fenda na molécula.

Grupo Heme

Fendas aonde o heme se insere

Quando o ferro está em estado ferroso (carga +2), liga-se ao O2. Quando em estado férrico (carga +3), não liga-se ao O2. Isso é facilmente justificável, uma vez que o ferro está na molécula segundo a seguinte composição:


Portanto, quando estiver em estado férrico, é sinal de que está ligado nas duas pontas transversais à porfirina. Quando ferroso, ainda pode realizar uma ligação (no caso, com o oxigênio).

A mioglobina tem maior afinidade pelo ferro do que a hemoglobina. Isso auxilia na função de armazenamento, pois precisa segurar o O2 por um longo tempo na molécula. A hemoglobina, por sua vez, precisa soltar os gases com frequência. Isso acarreta numa menor afinidade pelo O2.
Além disso, vale ressaltar que a ligação do primeiro O2 é mais difícil, facilitando a entrada de outros. Assim, temos o seguinte gráfico de Saturação da mioglobina e da hemoglobina pelo O2:

A hemoglobina pode se encontrar no estado T ou no estado R. O oxigênio liga-se à hemoglobina em ambos os casos, apesar de haver diferença de estabilidade.

O estado T seria o estado mais estável da hemoglobina quando não ligada ao O2. No entando, quando ligada ao O2, o estado T não fica tão estável e, com o passar do tempo, vai alterando sua conformação para o estado R. Na desoxihemoglobina, a justificativa para o estado T ser estável são as ligações iônicas nele presentes. Esse estado está geralmente "vazio", sem O2.

O estado R é o estado mais estável quando a hemoglobina está ligada ao O2. Quando não ligada ao O2, a proteína comporta-se de maneira muito instável, uma vez que sua conformação é favorável à presença da ligação com o O2. Esse estádo está geralmente "fechado" e com O2.



Desse modo, podemos tirar algumas conclusões:

- a hemoglobina é uma proteína alostérica (cuja definição será vista na próxima aula);

- o estado T predomina na desoxihemoglobina enquanto o estado R predomina na oxihemoglobina;

- a curva de saturação da hemoglobina é sigmóide.

Bioquímica - Aula Teórica 02 - Aminoácidos: estrutura e função

A segunda aula iniciou-se com a apresentação da formação de uma proteína, que se dá através do seguinte fluxo da informação gênica:



Então falamos a respeito da ligação peptídica, pela qual passaremos rapidamente, pelo fato de todos terem noção e de ser relativamente simples:


Há também peptídeos que são biologicamente ativos, mesmo sem formar proteínas. Exemplos são o glucagon, a insulina e a oxitocina. Diz-se convencionalmente que a partir de 100 aminoácidos, considera-se a substância como uma proteína, e não como um peptídeo, apesar de não ser oficial. Lembrando sempre que a variabilidade de proteínas é muito grande. A menor proteína de que se tem conhecimento é o Citocromo C, com 104 aminoácidos (uma cadeia peptídica somente).

Algumas características das proteínas:

- aminoácidos estão dispostos em ordem definida geneticamente
- uma cadeia: monômero / duas ou mais: oligômero
- somente aminoácidos: simples / aminoácidos + grupo prostético: conjugado

As cadeias peptídicas tendem a assumir a conformação espacial ideal. Um exemplo é o grupo heme, o qual será utilizado na fixação e no transporte do O2 pela hemoglobina e será discutido mais tarde.

Ligação Peptídica:

A ligação peptídica é rígida, formada por uma ligação covalente. Existe ressonância nas interações das cadeias, o que limita a deformação.

Conformação/Solubilidade/Função:

Globulares - usualmente solúveis
- função móvel ou dinâmica
- ex.: hemoglobina

Fibrosas - usualmente insolúveis
- função estrutural
- ex.: queratina

Níveis de Organização Estrutural das Proteínas

> estrutura primária: aminoácidos ligados entre si na cadeia

> estrutura secundária: padrão de enrolamento de secções (por exemplo, em hélice)

> estrutura terciária: dobramento das estruturas secundárias

> estrutura quaternária: não são todas as proteínas que possuem esse tipo de estrutura; é a interação de estruturas terciárias, ou seja, a interação de subunidades monoméricas (um exemplo de subunidade é uma cadeia alfa)


Estrutura Primária:

É a mais simples; consiste de aminoácidos ligados lado a lado formando uma cadeia peptídica. Quando só há um tipo de estrutura primária, diz-se que ela possui uma única função.

Estrutura Secundária:

É o arranjo da estrutura no espaço; conformação dos resíduos em relação aos adjacentes. É limitada pelo caráter parcial de dupla ligação peptídica e pelo tamanho e interações dos grupos R.

Tipos:

* Alfa-hélice: - segmentos de aminoácidos giram para a direita em formato de hélice;
- os aminoácidos não podem permitir o enrolamento;
- exceção: colágeno (hélice para a esquerda)

É bom observar que o plano das ligações peptídicas é paralelo ao plano do eixo, com uma média de 3,6 aminoácidos a cada volta. Os radicais (grupos R) projetam-se para o lado de fora da hélice.


A estabilidade dessa hélice depende de: pontes de hidrogênio; atração ou repulsão eletrostática entre os radicais; tamanho dos grupos R adjacentes; e resíduos de prolina e hidroxiprolina (estes geralmente colocam fim à alfa-hélice).

* Beta-conformação:

Ao contrário da alfa-hélice, a beta-conformação consiste de uma cadeia em ziguezague, que possui uma certa flexibilidade. As cadeias apresentação pontes de hidrogênio entre si. A cadeia de beta-conformação é representada por uma seta.




Esse tipo de conformação costuma ter algumas alças entre uma cadeia e outra, sendo que a prolina é muito comum nessas alças.


Estrutura Terciária:

Nesse tipo de estrutura, há o dobramento de cadeias de estrutura secundária. Logo, muitos aminoácidos que estão muito distantes dentro das cadeias passam a se relacionar, ficando bastante próximos uns dos outros. Há um certo padrão de dobramento da cadeia, e sabe-se que os grupos R polares ficam na superfície enquanto os grupos R apolares encontram-se na parte interior.

A estabilidade depende de:

- interações hidrofóbicas entre os grupos R apolares
- pontes de H
- pontes dissulfeto
- alfa-hélice
- beta-conformação
- interações complementares

Desnaturação:

A desnaturação de uma proteína pode ser promovida pelos seguintes agentes:

- calor
- pH
- agentes desnaturantes (etanol / ureia / sulfato de amônio / hidrocloreto de guanidina)

Assim encerra-se a segunda aula de bioquímica.

Bioquímica - Aula Teórica 01 - Aminoácidos: estrutura e função

Na primeira aula de Bioquímica, começamos estudando aminoácidos e proteínas.

O termo "proteína" provém de protos, ou seja, "a primeira". Como o próprio nome já diz, foi a primeira macromolécula a estruturar-se. A proteína é formada por ligações entre aminoácidos. Estes são as unidades monoméricas das proteínas, e associam-se entre si através das ligações peptídicas.

O aminoácido mais simples é a glicina, cujo radical corresponde a um H (não entraremos em detalhes a respeito da estrutura dos aminoácidos, pois além de ser trabalhado em BioCel na parte de bases macromoleculares, é plausível que todos tenham conhecimento suficiente para saber o que são proteínas e qual sua estrutura). Temos também a alananina, cujo radical corresponde a um grupo metil.

As proteínas que compõem o corpo humano são predominantemente levógiras (uma vez que assemelham-se ao esteroisômero L-gliceraldeído). A polaridade das proteínas determina a localização e a solubilidade delas.

Temos algumas estruturas diferenciadas das demais, como a da prolina, que por não ter uma cadeia alifática é considerada uma exceção, e a da cisteína, cuja característica é formar pontes dissulfeto em sua composição (apesar de não ser a única).

Foi discutido a respeito de aminoácidos essenciais, os quais o ser humano não é capaz de produzir, mas como são necessários, temos que ingeri-los. Ao contrário desses, temos os não essenciais, que apesar de serem importantes para o organismo humano, podem ser produzidos pelo nosso próprio corpo. Também foi citado algo sobre aminoácidos modificados, que nada mais são do que alterações nas estruturas dos aminoácidos já conhecidos. Como exemplo disso, temos a hidroxiprolina.

Discorremos ainda sobre a forma zwitteriônica de um aminoácido, que é sua configuração quando ele se encontra de maneira dipolar (ou sejam com cargas positiva e negativa.

Titulação por Equivalentes em OH a 25 ºC

Em seguida, foi explicado a respeito da titulação por equivalentes em OH. Acredito que todos sabem como funciona o processo, mas em todo caso, consiste de adicionar OH pouco a pouco e, através da variação do pH, determinar as características elétricas da substância em discussão.

Ácido Diprótico Monoamino Monocarboxílico

Esses ácidos possuem uma única amina e uma única carboxílica, e portanto pode ceder dois prótons (H+). Por possuírem dois pKs, o gráfico da titulação seria parecido com o seguinte:





Como alguns confundem, é bom deixar claro que pKa é simplesmente a constante de ionização representada pela fórmula pK = - log [produtos]/[reagentes]. Evidentenmente, com o aumento do pH, o pK irá variar. O que nos interessa nesse momento? Interessa saber que em pk 1 e em pk 2, a solução funciona como um tampão, e que em pkI temos o ponto isoelétrico, em que as cargas se equivalem.

Para calcular o pI, basta somar os pKs e dividi-los por 2 (fazer uma média aritmética simples). Entretando, há aminoácidos com mais radicais ionizáveis. Nesse caso, para determinar o ponto isoelétrico, basta encontrar a molécula em estado neutro e fazer a média aritmética dos pKs adjacentes. Como fica um pouco vago, tentarei demonstrar através de um esquema:






Além disso, é importante salientar que a histidina é o único aminoácido capaz de servir de tampão biológico, uma vez que forma uma solução tampão a um pH aproximadamente igual a 7.

E assim acaba a primeira aula teórica de Bioquímica.

Biologia Celular - Aula Teórica 03 - MB: Estrutura

A aula foi iniciada falando-se a respeito da estrutura da membrana biológica.

Os lipídios de membrana podem ser divididos em:

Fosfolipídios

- Glicerofosfolipídios:

- Esfingolipídios:

Glicolipídios

Esfingolipídios:


Esteróis

Quatro anéis hidrocarbônicos unidos.



Os lipídios possuem uma parte hidrofílica, que seria a sua "cabeça", e uma parte hidrofóbica, que seria sua "cauda". Isso determina várias de suas propriedades em relação ao seu comportamento. Por exemplo: a parte hidrofóbica irá interagir facilmente com estruturas apolares, enquanto que a parte hidrofílica terá afinidade por estruturas polares, como o solvente universal (a água).
Quando há duplas ligações na cadeia do lipídio, ele tem flexibilidade, enquanto as ligações simples determinam rigidez.

Um exemplo de lipídio que foi citado é a ceramida, composta por amida + esfingosina. O colesterol também é um importante lipídio.

Esteróides

Um esteróide possui:
- cadeia carbônica ramificada
- grupo hidroxila
- molécula compacta e rígida

Ou seja, quanto mais colesterol houver, maior será a rigidez e menor será a permeabilidade.


Proteínas de Membrana

As proteínas de membrana podem ser divididas em:

- Integrais => são as principais, auxiliam nos processos químicos, entre outras funções; atravessam a membrana plasmática;

- Periféricas => estão ao redor da camada bilipídica, estando a maioria voltada para a face interna.

Podemos dividi-las ainda em:

- Unipasso => atravessam uma única vez a membrana;

- Multipasso => atravessam duas ou mais vezes a membrana.

As proteínas de membrana podem encontrar-se ou de maneira transmembrana, ou ligadas ao lipídio, ou ligadas à proteína.

As funções que elas exercem são:

- transporte seletivo;
- enzimática;
- receptora de células de superfície;
- identificação;
- adesão celular;
- ligação ao citoesqueleto;
- elo de ligação.

Fim da terceira aula de biocel.

Biologia Celular - Aula Teórica 02 - MB: Composição

A segunda aula de BioCel diz respeito a Membranas Celulares ou Biológicas.

A membrana celular é uma estrutura da célula, de aspecto trilaminar, com espessura de 6 a 10 nm (60 a 100 A*).

Suas funções são as seguintes:

- manter o ambiente químico favorável para as reações
- reconhecer outras células (ou estruturas)
- processar informações (estímulos e sinais externos)
- movimentação e expansão
- controlar a entrada e a saída de moléculas/íons na célula

Lembrando que composição do líquido intracelular e a do líquido extracelular são bastante diferentes, logo a manutenção de um ambiente favorável é de suma importância.

A membrana celular é composta quimicamente por lipídios, proteínas e glicídios.

Basicamente (falando de maneira bem superficial mesmo), os açúcares processam os estímulos, os lipídios tem função estrutural e as proteínas têm funções bem variadas.

Lipídios de Membrana

Os lipídios da membrana, como já foi dito anteriormente, têm principalmente função estrutural. São quimicamente complexos e consistem de moléculas anfipáticas (ou seja, há uma parte polar e uma parte apolar; também pode-se dizer anfifílicas).

Resumidamente, a segunda aula de Biologia Celular foi essa.